David Jiménez, Steven AlexanderBarrera Ocampo, Álvaro AndrésCoy Gómez, GabrielaPérez Giraldo, Estefanía2025-06-162025-06-162024-06-12https://hdl.handle.net/10906/130373Molecular tests represent a key tool in the diagnosis of various diseases, particularly those of infectious origin. During the pandemic, these tests became the cornerstone of diagnosis due to their versatility, speed, specificity, and sensitivity, as they allowed for the implementation of timely treatments and epidemiological containment measures. The RT - qPCR technique enabled the detection of the SARS - CoV - 2 virus; however, the overwhelming demand for these tests generated a shortage of critical supplies, particularly the MMVL - RT enzyme, essential for performing the technique. Therefore, in response to this scarcity and with the aim of ensuring a local supply of reverse transcriptase, Icesi University has proposed a comprehensive methodology for its obtention and storage. This methodology covers the production, stabilization, and evaluation of recombinant RT enzyme obtained in - house from Escherichia coli BL21(DE3). The work sequence includes the expression of the MMLV - RT enzyme in E. coli BL21(DE3) bacteria, followed by its purification through affinity chromatography using a histidine tag. Furthermore, the formulation of the enzyme in a storage buffer and the qualitative evaluation of enzymatic activity allowed for a comprehensive assessment of the quality attributes of the enzyme stored for one month. The result obtained was an enzyme with a high degree of purity, specific and functional, retaining its activity even after one month of storage at temperatures of 4ºC and - 20ºC.Las pruebas moleculares representan una herramienta clave en el diagnóstico de diversas enfermedades, particularmente las que son de origen infeccioso. Durante la pandemia, estas pruebasse convirtieron en el pilar del diagnóstico debido a su versatilidad, rapidez, especificidad y sensibilidad pues permitieron implementar tratamientos y cercos epidemiológicos oportunos. La técnica de RT-qPCR permitió la detección del virus SARS- CoV-2; sin embargo, la abrumadora demanda de estas pruebas generó un desabastecimiento de suministros críticos, en particular, la enzima MMVL-RT, esencial para ejecutar la técnica. Por ende, en respuesta a esta escasez y con el objetivo de asegurar un suministro local de la retrotranscriptasa, la Universidad Icesi ha propuesto una metodología integral para su obtención y almacenamiento. Esta metodología abarca la producción, estabilización y evaluación de la enzima RT recombinante obtenida in-house a partir de Escherichia coli BL21(DE3). La secuencia de trabajo comprende la expresión de la enzima MMLV-RT en bacterias E. coli BL21(DE3), seguido de su purificación mediante cromatografía de afinidad utilizando una cola de histidina. Además, la formulación de la enzima en un buffer de almacenamiento y la evaluación cualitativa de la actividad enzimática permitieron una valoración exhaustiva de los atributos de calidad de la enzima almacenada durante un mes. El resultado obtenido fue una enzima con alto grado de pureza, específica y funcional, conservando su actividad incluso después de un mes de almacenamiento a temperaturas de 4ºC y -20ºC.2. INTRODUCCIÓN . . . . . 5 -- 3. METODOLOGIA . . . . . 11 -- 3.1 Producción de la enzima . . . . . 11 -- 3.1.1 Preparación de material y medios de cultivo . . . . 11 -- 3.1.2 Pre - inoculo . . . . . 12 -- 3.1.3 Expresión de la enzima MMLV RT recombinante . . . . 12 -- 3.1.4 Purificación de la enzima MMLV RT recombinante . . . 12 -- 3.1.5 Regeneración columna HisTrap TM FF 1 mL . . . . 13 -- 3.2 Determinación de formulación . . . . . 14 -- 3.3 Evaluación de la estabilidad de la enzima . . . . 14 -- 3.4 Atributos de calidad de la enzima . . . . 14 -- 3.4.1 Actividad biológica . . . . . 15 -- 3.4.2 Identidad de la proteína . . . . . 16 -- 3.4.3 Cuantificación de la proteína . . . . . 16 -- 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN . . . . . 17 -- 5. CONCLUSIONES . . . . . 30 -- 6. AGRADECIMIENTOS . . . . . 30 -- 7. REFERENCIAS: . . . . . 3133 páginasDigitalapplication/pdfspaEL AUTOR, expresa que la obra objeto de la presente autorización es original y la elaboró sin quebrantar ni suplantar los derechos de autor de terceros, y de tal forma, la obra es de su exclusiva autoría y tiene la titularidad sobre éste. PARÁGRAFO: en caso de queja o acción por parte de un tercero referente a los derechos de autor sobre el artículo, folleto o libro en cuestión, EL AUTOR, asumirá la responsabilidad total, y saldrá en defensa de los derechos aquí autorizados; para todos los efectos, la Universidad Icesi actúa como un tercero de buena fe. Esta autorización, permite a la Universidad Icesi, de forma indefinida, para que en los términos establecidos en la Ley 23 de 1982, la Ley 44 de 1993, leyes y jurisprudencia vigente al respecto, haga publicación de este con fines educativos Todo persona que consulte ya sea la biblioteca o en medio electróico podrá copiar apartes del texto citando siempre la fuentes, es decir el título del trabajo y el autohttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/bachelor thesis-info:eu-repo/semantics/openAccessAttribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 InternationalRetrotranscriptasaPruebas molecularesEnzimaDiagnosticoRT - PCREnzima MMLV - RTReverse transcriptaseMolecular testsEnzymeDiagnosisRT - PCRMMLV - RT EnzymeTrabajos de grado de Química Farmacéuticainstname:Universidad Icesireponame:Biblioteca Digitalrepourl:https://repository.icesi.edu.co/http://purl.org/coar/access_right/c_abf2