Identificación In - silico e In - vitro de genes housekeeping en raíces de Cecropia angustifolia

Abstract

In order to contribute to the exploitation of the chemical potential of diversity in the tropical region of the Colombian Andes, the natural products research laboratory at Icesi University has been working with Cecropia angustifolia, focusing special attention on its pentacyclic triterpene acids (TPAs), which are recognized as its chemotaxonomic markers. However, the metabolic pathways in this particular genus have not been studied in depth, so analyses of the enzymatic processes for the production of its metabolites must be based on models corresponding to different species. These models are inherently variable given the differences between each species and C. angustifolia. Therefore, a process of understanding the plant's metabolic processes must begin with the identification of housekeeping genes (HK) that can serve as biological markers and provide a reliable reference for comparing gene expression under different environmental conditions and/or tissues. Thus, the objective of this project was to evaluate the genes encoding the GAPDH, ACT, and TUB proteins as possible housekeeping genes, using bioinformatics tools, molecular techniques, and in vitro cultures of C. angustifolia root tissues. To achieve this objective, a literature review of the GAPDH, ACT, and TUB genes present in species taxonomically close to C. angustifolia was conducted. Then, specific primers for each gene were designed using different bioinformatics tools, followed by in vitro validation using mRNA extracted from C. angustifolia tissues. The obtained results were verified by Sanger sequencing, which found the presence of molybdopterin biosynthesis protein and the TUB gene (β - tubulin) in the tissue sample used. The results reported in the present investigation require further depth and serve as a basis for future research on the characterization of HK genes in C. angustifolia.

Con el fin de realizar aportes al aprovechamiento del potencial químico de la diversidad en la región tropical de los andes colombianos, el laboratorio de investigación en productos naturales de la Universidad Icesi ha venido trabajando con Cecropia angustifolia y enfocando especial atención sobre sus triterpenos pentacíclicos ácidos (TPAs), los cuales son reconocidos como sus marcadores quimiotaxonómicos1. No obstante, las rutas metabólicas en este género en particular no han sido estudiadas a profundidad, por lo que los análisis de los procesos enzimáticos para la producción de sus metabolitos deben basarse en modelos correspondientes a especies distintas. Estos modelos son inherentemente variables dadas las diferencias entre cada especie y C. angustifolia. Por lo cual, un proceso de reconocimiento de los procesos metabólicos de la planta debe iniciar con la identificación de genes housekeeping (HK) que puedan servir como marcadores biológicos y proporcionar una referencia confiable para comparar la expresión génica en diferentes condiciones ambientales y/o tejidos. De este modo, el objetivo de este proyecto fue evaluar, los genes que codifican las proteínas GAPDH, ACT y TUB como posibles genes housekeeping, haciendo uso de herramientas bioinformáticas, técnicas moleculares y cultivos in vitro de tejidos radiculares de C. angustifolia. Para cumplir con este objetivo, se realizó una revisión bibliográfica de los genes GAPDH, ACT y TUB presentes en especies taxonómicamente cercanas a C. angustifolia, luego, empleando diferentes herramientas bioinformáticas se diseñaron primers específicos para cada gen para después realizar una validación in-vitro empleando mRNA extraído de tejidos de C. angustifolia. Los resultados obtenidos se verificaron mediante secuenciación Sanger, en la cual se encontró la presencia de proteina de biosíntesis de molidopterinasy del gen TUB (β-tubulina) en la muestra de tejido empleada. Los resultados reportados en la presente investigación requieren mayor profundización y sirven de base para futuras investigaciones sobre caracterización de genes HK en C. angustifolia.